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　　關鍵詞  高效液相色譜質譜，固相多肽合成，消旋，多肽測序

　　1  引言

　　1963年Merrifield創建了固相多肽合成，用簡單的洗滌操作代替了經典合成方式中的分離、重結晶、板層和柱層等純化操作，其優越性使該方法廣泛用于各種模式多肽和天然多肽的制備。但產物消旋是合成中普遍存在的現象，即原料氨基酸為L型（或D型），而產物中某些氨基酸殘基會轉變為D型（或L型）[1]，從而影響終產品純度與收率。因此，防止消旋化成為多肽合成中一個十分重要的問題，而消旋產物的檢測與分析是其中的關鍵。

　　RPHPLC具有極高的分辨率，已廣泛應用于多肽和蛋白的分離。由于多肽在疏水性固定相表面上的吸附與解吸不僅取決于氨基酸序列，而且與其空間結構有關，即“疏水腳”的細微差別將使構象不同的多肽具有不同的色譜保留行為[2]。因此，RPHPLC可有效分離序列幾乎完全相同的多肽及多肽的消旋化產物[ 3～5]。

　　本研究對采用HBTU/Fmoc固相法[6]化學合成弱疏水性七肽（H2NPFNSLAICOOH）時出現的消旋產物進行了RPHPLC/MS分析：基于適用于不同分離對象的塔板理論[7]、Onoff理論[8]和計量置換理論[9]等已有RPHPLC保留機理，根據弱疏水性多肽特性 ，提出“早期吸附”概念，并經色譜條件優化，得到了峰形良好的譜峰。通過將不同MSn條件下所得離子碎片和豐度信息進行選擇性疊加[10]，實現了對每一多肽的一級測序，由此成功分析了合成七肽的4個消旋產物，為消旋化檢測提供了一種新方法。

　　2  實驗部分

　　2.1  儀器和試劑

　　高效液相色譜系統(大連依利特分析儀器有限公司),包括P200Ⅱ型高壓恒流泵、UV200Ⅱ紫外可變波長檢測器和Echrom98色譜工作站。色譜柱：Lichrosorb RP18, 粒徑5 μm, 填料孔徑10 nm, 200 mm×4.6 mm（美國惠普公司）；Lichrospher 100 C18, 粒徑5 μm, 填料孔徑10 nm, 250 mm×4 mm（德國Merck公司）;液/質聯用儀：電噴霧離子阱質譜LCQ Advantage MAX，Bioworks 3.0數據處理軟件（美國Thermo Finnigan公司）。七肽按文獻[11]采用固相法手工合成；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；三氟乙酸（TFA）（色譜純，迪馬公司）；超純水（自制）。

　　2.2  色譜條件

　　流動相：A液：水（0.1％TFA）；B液：乙腈（0.1％TFA）。最優梯度洗脫模式：0→10 min，B液0→7%；10→14 min，B液7％→30%；14→48 min，B液30％→50%。柱溫：室溫；流速：0.7 mL/min；檢測波長214 nm；樣品用60%乙腈/水溶解，濃度5 g/L；進樣量20 μL。

　　2.3  質譜分析

　　色譜條件同上。電噴霧電離（ESI），正離子檢測，碰撞氣為氦氣，霧化氣（N2）流速5 μＬ/min，源溫200℃，霧化壓力0.345 MPa；掃描范圍：50～2000 m/z。第一次質譜分析采用全掃描，以獲得每個色譜峰準確且單一的m/z值，隨后的質譜分析中改變相對碰撞能量等參數以獲得一系列MS2圖譜來完成多肽測序，采用Bioworks 3.0軟件分析碎片信息，按文獻[10]方法進行譜圖的疊合解析。

　　3  結果與討論

　　3.1  合成七肽粗品的質譜直接進樣分析

　　對合成七肽粗品用質譜注射泵直接進樣進行全掃描分析，得到單一的m/z 761.5 [M＋H]+ 峰，與目標多肽分子量760.9吻合，說明合成產物純度很高，并未生成大量斷頭肽和空心肽之類的雜質。  

　　3.2  合成七肽粗品的RPHPLC分析

　　3.2.1  弱疏水性多肽RPHPLC保留行為解析  RPHPLC中溶質保留機理的預測一直是色譜理論研究的熱點，迄今為止提出的模型多達10余種，應用較多的主要有：適用于小分子物質的塔板理論[7]、Snyder經驗公式、溶解度參數模型、溶劑色效模型、疏溶劑化模型等[8]；而對于生物大分子而言，Onoff模型[9]、尤其是耿信篤提出的計量置換保留理論（SDTR）是目前公認的保留機理[8]。
  
　　基于吸附機制提出的Onoff模型認為：在多肽及蛋白質的RPHPLC分析中，初始洗脫條件下有機改性劑濃度較低，溶質分子與固定相之間的疏水作用較強，幾乎完全吸附，“停滯”不動。而一旦洗脫液中有機改性劑（或稱為強溶劑、置換劑等）達到臨界濃度，使得多肽或蛋白質與流動相間的作用大于其與固定相的作用，則溶質“瞬時”解吸到流動相，并形成尖銳的洗脫峰，此后溶質與固定相無任何作用。這一理論對于疏水性很強的蛋白質和多肽等大分子物質是適用的。

　　對于實驗中合成的弱疏水性七肽（親疏水性值按文獻[12]方法計算為－6.1），本研究提出可將色譜柱前后分為吸附段a和分配段b兩段，并認為溶質的色譜保留行為是吸附和分配兩種機理的綜合。初始洗脫條件下有機改性劑濃度較低，溶質被完全吸附于a段，為吸附機制控制；當洗脫液中有機改性劑達到臨界濃度，多肽被瞬時洗脫后，并非像“Onoff”理論所述溶質與固定相之間再無任何關系，而是在b段仍有一定作用，為分配機制所控制。為了增大分配機制在b段的貢獻，可引入“早期吸附”過程，即將初始洗脫液中有機改性劑濃度設為極低值，并保持一段時間（約10 min）。此時，由于流動相溶劑與被分離多肽之間的作用力遠遠小于固定相與多肽之間的作用力，則樣品在初期即可快速而完全地吸附于固定相上。因此前段的吸附段a明顯縮短；又由于每根色譜柱柱長一定，a段縮短相對延長了后段分配段b的長度，因此，可實現增大b段中分配機制貢獻的目的。如圖１所示，當引入“早期吸附”后，分離度得到改善；反之，當舍棄“早期吸附”時，則溶質未能充分吸附即被快速洗脫，所以出峰較早、分離度較差（圖２）。 

　　圖１  引入“早期吸附”合成七肽的色譜圖（略）

　　Fig.１  Chromatogram of heptapeptide with preadsorption

　　B%為流動相中B液的體積分數（B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
　　
　　在相同洗脫條件下，使用３支不同塔板數的C18色譜柱分析該七肽。如果按Onoff理論所述單純由吸附控制，則分離度與塔板數無關，應得到相同的譜圖。但實驗結果卻發現，分離度有一定差異（圖３），說明b段的分配機制對分離效果確有影響。綜合考慮a、b兩段，可以證明：弱疏水性小肽的RPHPLC保留行為不同于疏水性蛋白，是分配和吸附雙重機制共同作用的結果。
 
　　圖2  舍棄“早期吸附”的合成七肽色譜圖（略）

　　Fig.2  Chromatogram of heptapeptide without preadsorption

　　B%為流動相中B液的體積分數(B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。 

　　圖３  ３支不同塔板數的C18色譜柱分析（略）

　　Fig.３  Analysis using three C18 chromatographic columns with different plate numbers

　　1. Lichrosorb RP18（10 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(plate numbers)=6000; 2. Lichrosorb RP18（5 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm） 塔板數(plate numbers)=12000; 3. Lichrospher100 C18（5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm） 塔板數 (plate numbers)=15000。
　　3.2.2  RPHPLC分析條件優化  首先用純乙腈和純水組成的梯度洗脫體系分析合成七肽粗品（圖４A），峰1（圖中標識）未得到理想分離；隨后不斷降低梯度斜率，以使峰1與其它譜峰分開，得到一系列色譜圖（圖４B、４C、４D）。由圖可知：隨著梯度斜率的緩慢降低，分離度得到改善，但峰形逐漸變鈍，并發生托尾。這說明疏水性蛋白和多肽對有機改性劑的變化較為敏感[13]；相反弱疏水性小肽（即本文所合成七肽的消旋產物，對應于圖４中各譜峰）則反應“遲鈍”。即將后者從固定相上洗脫所需溶劑突越范圍較寬[14]，改變梯度斜率對其影響相對較小。所以，當梯度斜率降至一定程度時，只有改變其它色譜條件方能得到理想峰形。

　　圖4  不同梯度條件下的合成七肽（弱疏水性肽）色譜圖（略）

　　Fig.4  Chromatograms of heptapeptides (i.e. weak hydrophobic peptides) at different gradient elution conditions

　　B%為流動相中B液的體積分數(lichrospher100 C18, 5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm; B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。

　　在流動相中加入0.1%的TFA，如圖５所示（洗脫模式見2.2），分離效果理想，共得到4個譜峰。根據3.1質譜直接進樣分析結果，初步證明4個譜峰對應于七肽的4個消旋產物。

　　3.3  液質聯用對合成七肽消旋產物的測序分析

　　首先采用LC/ESI/MS對圖５中的4個譜峰進行全掃描，發現4個譜峰的m/z均為761.5；隨后進行第二次實驗，使用LC/ESI/MS2對每一譜峰進行在線多肽測序，通過改變相對碰撞能量６０、３８和２５ eV，得到豐富的碎片信息。結果表明：4種產物的分子量和序列完全一樣，是合成七肽的4個消旋產物，由排列組合分析可以推斷是肽鏈上的兩個氨基酸殘基發生了消旋[15]。

　　在進行MS2測序時，很難在同一質譜條件下得到全部碎片信息。不同條件下得到的圖譜在碎片離子峰的多少和信號強弱的分布區域等方面具有一定的互補性，可以有選擇地將譜圖疊合起來進行分析，從而達到簡化串聯質譜解析和提高多肽測序準確性的目的[10]。圖６為二級質譜分析中合成七肽的b軸和y軸片段信息，由此確定了合成七肽的4個消旋產物。 

　　圖５  合成七肽最優色譜圖（略）

　　Fig.５  Optimized chromatogram of heptapeptide 

　　圖６  譜圖疊加后的合成七肽MS2分析（略）

　　Fig.６  MS2 analysis of heptapeptide by spectrum superposition

　�。粒�合成七肽b軸與y軸斷裂碎片示意圖(b and y fragment ions of synthsized heptapepetide); B. 合成七肽MS2譜圖(MS2 spectrum of synthesized heptapepetide)。

　　3.4  小結

　　本研究對采用HBTU/Fmoc固相法化學合成弱疏水性七肽（H2NPFNSLAICOOH）時出現的消旋現象進行了RPHPLC/MS分析：（1）討論了弱疏水性七肽在RPHPLC中保留機理的特殊性，基于塔板理論、onoff理論和計量置換理論提出了“早期吸附”概念，以此優化色譜條件可充分利用分配和吸附雙重保留機制來改善分離效果，并最終得到4個峰形良好的色譜峰；（2）質譜直接進樣分析表明：4譜峰具有相同的m/z 761.5 [M＋H]+ 值，與目標多肽分子量760.9吻合，對應于合成七肽的4種消旋產物；（3）對每一譜峰進行在線多肽測序，將不同MS2條件下的離子碎片和豐度信息進行選擇性疊加，得到b軸和y軸的碎片信息，成功地分析了合成七肽的4個消旋產物。

　　References

　　1  Grandas A, Jorba X, Giralt E, Pedroso E. Int. J. Ｐeptide Ｐrotein Res., 1989, 33: 386~390

　　2  Zhu Xiaonan（朱曉囡）, Su Zhiguo（蘇志國）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）, 2004, 32(2): 248 ~ 254

　　3  Rivier J, Mcclintock R. J. Chromatogr., 1983, 268: 112~119

　　4  Malkinson J P, Zloh M, Kadom M, Errington R. Org. Lett., 2003, 5 (26):  5051~5054

　　5  Hori Y, Fujisawa M, Shimada K. J. Chromatogr. B, 2002, 776 (2): 191~198

　　6  Kates S A, Albericio F. SolidPhase Synthesis, New York: Marcel Dekker, Inc., 2000: 89~97

　　7  Martin A J P, Synge R L M. Biochem. J., 1941, 35: 1358

　　8  Geng Xindu（耿信篤）. Stoichiometric Displacement Theory and Its Application（計量置換理論及應用）． Beijing（北京）: Science Press（科學出版社）, 2004: 76 ~ 82

　　9  Tennikov M B, Gazdina N V, Tennikova T B. J. Chromatogr., 1998, 789: 55~64

　　10  Wang Xianchun（王賢純）, Liang Songping（梁宋平）. Acta Biochim. Biophys. Sin.（生物化學與生物物理學報）, 2001, 33 (6): 665~670

　　11  Jia C X, Qi W, He Z M, Yang H M, Qiao B. Cent. Eur. J. Chem., 2006, 4(2): 285~298

　　12  Hopp T P, Woods K R. Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 1981, 78: 3924~3828

　　13  Ｇevaert K, Staes A, van Damme J, de Groot S, Hugelier K, Demol H, Martens L, Goethals M, Vandekerckhove J. Proteomics, 2005, 5 (14): 3589~3599

　　14  Geng X D, Regnier F E. J. Chromatogr., 1984, 296: 15~30

　　15  Yun Kuihong（惲魁宏）, Gao Hongbin（高鴻賓）, Ren Guizhong（任貴忠）. Advanced Organic Chemistry（高等有機化學）． Beijing（北京）: Higher Education Press（高等教育出版社）, 1988: 70

　　本文系國家自然科學基金資助項目（No.20306023）

　�。ㄌ旖虼髮W化工學院化學工程研究所，天津 300072）    

　　（天津天士力集團，天津 ３００４０２）