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截留分子量選小啦！看到這個(gè)表，你是否發(fā)現(xiàn)原來(lái)抱怨Millipore超濾管流速偏慢的根源來(lái)自對(duì)于Millipore截留分子量定義的誤解。膜孔徑要小于目的分子這是第一原則。如果分子有近似球形的立體結(jié)構(gòu)(而非明顯的線性分子)，在Millipore再生纖維素超濾膜體系內(nèi)，選擇“等于”或“略小于”目的分子的截留分子量的超濾管是最佳選擇，這樣操作起來(lái)又快又好，既保證了樣品回收率，又縮短了離心時(shí)間，大幅降低大分子損傷風(fēng)險(xiǎn)。

Amicon® Ultra系列超濾管產(chǎn)品需要根據(jù)起始樣品體積、目標(biāo)蛋白或核酸的分子量、終體積及濃縮倍數(shù)等選擇具體型號(hào)。下表為選擇最適合截留分子量的超濾管提供了一些參考建議。

收取體積已經(jīng)很小的濃縮好的樣品時(shí)，你會(huì)：

A 購(gòu)買(mǎi)最尖細(xì)的槍頭，把樣品吸回來(lái) 

B 濃縮倍數(shù)低一點(diǎn)，以便用槍頭把樣品吸回來(lái)

C 反轉(zhuǎn)離心回收，獲得最高得率


正確答案“C”,你答對(duì)了么？
Millipore的Amicon® Ultra系列超濾管上樣體積有0.5/2/4/15/70mL等五種，除了采用低吸附的管材和最低蛋白吸附的再生纖維素超濾膜，其中0.5mL，2mL和70mL的規(guī)格還特別設(shè)計(jì)了反轉(zhuǎn)回收模式，以便使已經(jīng)濃縮的樣品最大化回收。

現(xiàn)在你總該知道為什么收到AU0.5的時(shí)候會(huì)有兩個(gè)外管了吧～

更多關(guān)于超濾管的正確使用問(wèn)題：

• 蛋白在濃縮時(shí)出現(xiàn)了沉淀，如何改進(jìn)？

  蛋白如果濃縮過(guò)快或者過(guò)度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過(guò)20mg/ml。對(duì)于對(duì)濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進(jìn)方法是：

  1）離心力降為推薦離心力的30%-50%

  2）改用截留分子量更大的超濾管（如原本選用10k，此時(shí)可以選擇30k） 

  3）在濃縮過(guò)程中取出超濾管，用槍頭反復(fù)吹吸幾次后再繼續(xù)濃縮

  4）體積較大的樣品可考慮選用攪拌式超濾杯，減少沉淀的發(fā)生。

• Amicon® Ultra超濾管可以用酒精消毒滅菌么？

  Amicon® Ultra與70%乙醇是兼容的，但是對(duì)滅菌處理的具體方法沒(méi)有做相關(guān)的測(cè)試，所以無(wú)法提供更進(jìn)一步的參考信息。建議采用Ultrafree無(wú)菌離心管對(duì)濃縮后的樣品進(jìn)行過(guò)濾除菌。

• Amicon® Ultra超濾裝置是否可以用于高壓滅菌？

  Amicon® Ultra都是采用熱封設(shè)計(jì)，不可以用高壓高溫滅菌。

• 懷疑濃縮過(guò)程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善？ 

  Amicon® Ultra超濾管使用的是再生纖維素膜，這種材質(zhì)是蛋白吸附最低的超濾膜。但是對(duì)于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會(huì)增強(qiáng)。對(duì)于這種情況，可以嘗試在實(shí)驗(yàn)前對(duì)超濾管進(jìn)行封閉處理，也可以嘗試換成Amicon® Ultra 0.5或2來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)減小膜面積來(lái)降低非特異性吸附。

• 有時(shí)候用超濾離心管連水都離不下來(lái)，可能是什么原因？

  Amicon® Ultra超濾膜中含有微量甘油。如果出現(xiàn)這種情況，請(qǐng)先用0.1 N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用，如暫時(shí)不用，請(qǐng)保持潤(rùn)濕狀態(tài)，避免重新干燥。

• 如果要用超濾的方法分離兩種蛋白，那么這兩個(gè)蛋白的大小需要相差多少？

  按照經(jīng)驗(yàn)，建議兩個(gè)蛋白的分子量要相差一個(gè)數(shù)量級(jí)（10倍）。

• 說(shuō)明書(shū)中推薦在室溫下進(jìn)行離心，考慮到蛋白的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進(jìn)行離心？

  可以，但是低溫會(huì)增加蛋白樣品的粘性，導(dǎo)致流速減慢，建議可將離心時(shí)間延長(zhǎng)到原來(lái)的1.5倍。
  

• 濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒(méi)有目的蛋白，可能的原因有哪些？

  首先，Amicon® Ultra超濾管的蛋白最低起始濃度為25ug/ml。請(qǐng)確保樣本的起始濃度大于這個(gè)濃度。其次，如果問(wèn)題仍然出現(xiàn)，請(qǐng)不要丟棄樣本濾過(guò)液以便用于分析可能的原因：

  1）如果目的樣本在濾過(guò)液中，那么請(qǐng)排查：

    a） 是否選擇了合適截留分子量的超濾管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？

    b）使用的離心力是否是在限定范圍內(nèi)？如果使用的是rpm，請(qǐng)換算成相應(yīng)的g離心力，具體換算方法請(qǐng)垂詢。

    c）離心機(jī)最近是否有校準(zhǔn)過(guò)？

    d）是否首次嘗試這個(gè)蛋白？如果能確保用同樣的超濾管對(duì)其它蛋白成功操作的話，那么有可能是這個(gè)目的蛋白的原因。有時(shí)蛋白會(huì)因其本身的一些特性（構(gòu)象差異）而影響濃縮效果，建議選用更小截留分子量的超濾管（如原本選用30k，此時(shí)可以選擇10k）

  2）如果目的樣本也不在濾過(guò)液中，那么：

    a）蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/mL？

    b）用來(lái)確定樣本濃度的方法是什么？是否可信？

    c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具體解決方法請(qǐng)參考上面的關(guān)于蛋白沉淀問(wèn)題的解釋。

TIPS

👍 快速大體積樣品超濾請(qǐng)選用Centricon Plus-70mL離心超濾管

👍 溫和而經(jīng)濟(jì)的Amicon攪拌式超濾杯(50/200/400mL)，可以滿足1L以內(nèi)的樣品濃縮脫鹽和膜通量測(cè)試。

👍 透析脫鹽換液請(qǐng)選用D-tube透析管(300uL～15mL)，溫和脫鹽換液，標(biāo)準(zhǔn)槍頭操作。

👍 核酸/法醫(yī)/質(zhì)譜樣品制備/藥物結(jié)合分析等請(qǐng)選用Microcon超濾管(0.5mL)，橫膜設(shè)計(jì)，沒(méi)有死體積，醫(yī)藥級(jí)O形圈。